咖啡因介紹
咖啡因是從咖啡或茶葉中提取的生物堿，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，但長(zhǎng)期或超量攝入有害。茶飲料中常含咖啡因，因此檢測(cè)其含量至關(guān)重要?！恫栾嬃稀窐?biāo)準(zhǔn)中有相關(guān)規(guī)定。本文基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，結(jié)合阿斯曼爾設(shè)備，建立了一套快速、高效的茶飲料咖啡因含量測(cè)定法，采用HPLC分析和外標(biāo)法定量，并通過(guò)加標(biāo)回收驗(yàn)證，利用全自動(dòng)液體工作站改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
關(guān)鍵詞
茶飲料，含量測(cè)定，咖啡因，液體工作站，HPLC
儀器及耗材
儀器： FlexStation P4-S1全自動(dòng)液體工作站 高效液相色譜儀（島津 SPD-20A） 液相色譜柱(C18）或同等性能的色譜柱 0.22μm微孔水相濾膜(上海安譜) 電子天平(精度0.1 mg，賽多利斯) |
耗材： 茶飲料(購(gòu)自某超市) 甲醇（HPLC級(jí)，麥克林） 純水 甲醇中咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液（500 mg/ml ，北方偉業(yè)） 氧化鎂(AR級(jí)，鼎盛鑫化工) |
實(shí)驗(yàn)步驟
咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制  以500 μg/ml咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液為源液，純水定容，于室溫平衡后用P4-S1的外標(biāo)曲線(xiàn)功能配制成濃度分別為1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。  試樣處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取5g(精確至0.001g)樣品，加純水定容至10ml(使樣品溶液中咖啡因含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)),搖勻，加入0.5 g氧化鎂，迅速上下振搖，使氧化鎂和待測(cè)茶飲料充分混勻，靜置待上層澄清，取1ml上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾待測(cè)。 液相色譜條件
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定性和定量 按照上述檢測(cè)波長(zhǎng)和流動(dòng)相條件，用5 μg/ml的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性，進(jìn)樣量10 μl。標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)下圖。咖啡因的出峰時(shí)間為5.258 min, 且標(biāo)準(zhǔn)品峰形對(duì)稱(chēng)。  標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
線(xiàn)性關(guān)系考察 將配制的質(zhì)量濃度為1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照2.3液相色譜條件上機(jī)測(cè)試，咖啡因的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)測(cè)得的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算曲線(xiàn)方程和線(xiàn)性系數(shù)。如圖所示。圖中表明咖啡因在1～200 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。按照國(guó)標(biāo)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料中咖啡因的測(cè)定》(GB 5009.139—2014)的方法中茶飲料的稱(chēng)樣量和定容體積，代入國(guó)標(biāo)方法的計(jì)算公式可得，茶飲料的檢出限均為0.6 mg/kg, 定量限為2 mg/kg。  咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
加標(biāo)回收率 稱(chēng)取9份陰性茶飲料，結(jié)合方法的線(xiàn)性范圍向1～3號(hào)試樣中添加0.5 mL濃度為1.96 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試樣處理過(guò)程操作，液相色譜條件測(cè)試，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率。向陰性茶飲料中添加0.15 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定6次，考察方法的重復(fù)性(用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示)，方法的重復(fù)性RSD為1.56%，具體見(jiàn)下表。由此可見(jiàn)，方法的加標(biāo)回收率與重復(fù)性均滿(mǎn)足GB/T 27404—2008中的規(guī)定，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
咖啡因的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(n=3) |
結(jié)果驗(yàn)證
為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度與精密度，本實(shí)驗(yàn)用已知咖啡因含量的復(fù)方對(duì)乙酰氨基酚片進(jìn)行驗(yàn)證（n=3）。測(cè)試結(jié)果如下表，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.48%。
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總結(jié)
綜上所述， 本方案標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配置我們采用全自動(dòng)液體工作站（FlexStation P4-S1），可實(shí)現(xiàn)混標(biāo)制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備、樣品添加和分液等液體樣品處理功能，全程無(wú)需人員值守，儀器程序化運(yùn)行可以有效避免人為誤差，保證曲線(xiàn)的精密度和準(zhǔn)確性。
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