咖啡因介紹
咖啡因是從咖啡或茶葉中提取的生物堿，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，但長期或超量攝入有害。茶飲料中常含咖啡因，因此檢測其含量至關(guān)重要。《茶飲料》標準中有相關(guān)規(guī)定。本文基于國家標準方法，結(jié)合阿斯曼爾設(shè)備，建立了一套快速、高效的茶飲料咖啡因含量測定法，采用HPLC分析和外標法定量，并通過加標回收驗證，利用全自動液體工作站改善實驗結(jié)果。
關(guān)鍵詞
茶飲料，含量測定，咖啡因，液體工作站，HPLC
儀器及耗材
儀器： FlexStation P4-S1全自動液體工作站 高效液相色譜儀（島津 SPD-20A） 液相色譜柱(C18）或同等性能的色譜柱 0.22μm微孔水相濾膜(上海安譜) 電子天平(精度0.1 mg，賽多利斯) |
耗材： 茶飲料(購自某超市) 甲醇（HPLC級，麥克林） 純水 甲醇中咖啡因標準溶液（500 mg/ml ，北方偉業(yè)） 氧化鎂(AR級，鼎盛鑫化工) |
實驗步驟
咖啡因標準溶液的配制  以500 μg/ml咖啡因標準溶液為源液，純水定容，于室溫平衡后用P4-S1的外標曲線功能配制成濃度分別為1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的系列標準溶液。  試樣處理 準確稱取5g(精確至0.001g)樣品，加純水定容至10ml(使樣品溶液中咖啡因含量在標準曲線范圍內(nèi)),搖勻，加入0.5 g氧化鎂，迅速上下振搖，使氧化鎂和待測茶飲料充分混勻，靜置待上層澄清，取1ml上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾待測。 液相色譜條件
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實驗結(jié)果
標準物質(zhì)的定性和定量 按照上述檢測波長和流動相條件，用5 μg/ml的咖啡因標準品進行定性，進樣量10 μl。標準溶液的色譜圖見下圖?？Х纫虻某龇鍟r間為5.258 min, 且標準品峰形對稱。  標準溶液色譜圖 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
線性關(guān)系考察 將配制的質(zhì)量濃度為1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的標準系列溶液按照2.3液相色譜條件上機測試，咖啡因的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標，其對應(yīng)測得的色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算曲線方程和線性系數(shù)。如圖所示。圖中表明咖啡因在1～200 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。按照國標《食品安全國家標準飲料中咖啡因的測定》(GB 5009.139—2014)的方法中茶飲料的稱樣量和定容體積，代入國標方法的計算公式可得，茶飲料的檢出限均為0.6 mg/kg, 定量限為2 mg/kg。  咖啡因標準曲線圖 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
加標回收率 稱取9份陰性茶飲料，結(jié)合方法的線性范圍向1～3號試樣中添加0.5 mL濃度為1.96 μg/mL的咖啡因標準溶液，按照試樣處理過程操作，液相色譜條件測試，計算方法的加標回收率。向陰性茶飲料中添加0.15 mL濃度為1963.04 μg/mL的咖啡因標準溶液，平行測定6次，考察方法的重復(fù)性(用相對標準偏差RSD表示)，方法的重復(fù)性RSD為1.56%，具體見下表。由此可見，方法的加標回收率與重復(fù)性均滿足GB/T 27404—2008中的規(guī)定，測定結(jié)果準確可靠。
咖啡因的加標回收試驗結(jié)果統(tǒng)計(n=3) |
結(jié)果驗證
為了驗證該方法的準確度與精密度，本實驗用已知咖啡因含量的復(fù)方對乙酰氨基酚片進行驗證（n=3）。測試結(jié)果如下表，相對標準偏差0.48%。
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總結(jié)
綜上所述， 本方案標準曲線的配置我們采用全自動液體工作站（FlexStation P4-S1），可實現(xiàn)混標制備、標準曲線制備、樣品添加和分液等液體樣品處理功能，全程無需人員值守，儀器程序化運行可以有效避免人為誤差，保證曲線的精密度和準確性。
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